Question 1

ماهو مفهوم الفصل الكهربائي الهلامي؟

Accepted Answer

يُعرف مفهوم الفصل الكهربائي الهلامي على انه طريقة معملية تستخدم لفصل خليط من الحمض النووي DNAأو RNA أو البروتينات وفقًا للحجم الجزيئي والشحنة الكهربائية. في الرحلان الكهربائي الهلامي، يتم وضع أو دفع الجزيئات المراد فصلها بواسطة مجال كهربائي عبر مادة هلامية (جيل)تحتوي على مسام صغيرة. تنتقل الجزيئات عبر مسام الهلام بسرعة ترتبط عكسياً بأطوالها. هذا يعني أن جزيء DNA الصغير سوف ينتقل عبر الهلام أو الجيل مسافة أكبر من جزيء DNA الأكبر. يتضمن الرحلان او الفصل الكهربائي الهلامي مجال كهربائي، يتم تطبيق هذا المجال بحيث يكون لأحد طرفي الهلام شحنة موجبة والطرف الآخر له شحنة سالبة؛ فعلى سبيل المثال نظرًا لأن DNA و RNA جزيئات سالبة الشحنة، فسيتم سحبها نحو النهاية الموجبة الشحنة من الهلام. أما البروتينات فهي ليست سالبة الشحنة؛ لذلك عندما يراد فصل البروتينات باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي، يجب أولاً خلط البروتينات بمنظف يسمى كبريتات دوديسيل الصوديوم sodium dodecyl sulfate. يجعل هذا العلاج البروتينات تتكشف وتظهر في شكل خطي وتغطيها بشحنة سالبة ، مما يسمح لها بالانتقال نحو النهاية الموجبة للهلام أو للجيل ومن ثم الفصل. أخيرًا، بعد فصل جزيئات الحمض النووي DNA  أو RNA أو البروتين باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي ، يمكن اكتشاف الحزم Bands التي تمثل جزيئات ذات أحجام مختلفة.

Question 2

ماهى العوامل التي تتحكم بحركة جزيئات الحمض النووي ـ DNA في الهلام  أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟

Accepted Answer

الشحنة. الجحم الجزيئي لشريط الحمض النووي (الجزيئات ذات الحجم الجزيئي الأصغر تتحرك أسرع من الجزيئات ذات الحجم الجزيئي الأكبر) تركيز هلام الاغاروز (عادة 0.8٪). تشكيل الحمض النووي (خطي / بلازميد / إلخ ..). قوة التيار الكهربي المستخدم . حجم الثقوب (الثقوب الصغيرة مناسبة لفصل الجزيئات الصغيرة والثقوب الكبيرة مناسبة لفصل الجزيئات الكبيرة) صبغة بروميد الإيثيديوم:  موجب الشحنة ؛ لذلك يقلل من معدل هجرة الحمض النووي بنسبة 15٪. تشمل الصبغات الأخرى للحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز SYBR Gold و SYBR green و Crystal Violet و Methyl Blue.

Question 3

ماهى طريقة الفصل الكهربائي الهلامي

Accepted Answer

هناك عدة خطوات أساسية لطريقة الفصل الكهربائي الهلامي، وهي: 1) صب وتحضير الهلام لتحضير هلام الأغاروز  Agarose ، نقوم بغلي عينة عادة ما تكون بتركيز 1% Agarose، وبعد الغليان يُصب في قالب ويترك ليبرد. بعد أن يبرد، سوف يتجمد في  شكل مصفوفة وعندما يصب الجل في القالب ، يتم وضع المشط داخل القالب في أحد طرفيه و لذلك الهلام يحتوي على عدة  ثقوب أو آبار.  2) تحضير العينات يقصد بتحضير العينة أن تضيف صبغة تحميل إلى عينة الحمض النووي. الغرض من صبغة التحميل هو السماح بتصوير هجرة العينات خلال الهلام، فبالرغم من عدم قدرتنا على رؤية جزيئات الحمض النووي نفسها لكن يمكننا مراقبة التقدم من خلال مراقبة الى أي مدى الصبغة (ذات الشحن السالبة ) قد انتقلت. ملحوظة: الصبغة الأكثر شيوعًا هي البروموفينول الأزرق التي تنتقل من خلال الهلام بنفس معدل جزيء DNA الذي يبلغ 300 نيوكليوتيد في الطول.  3) تحميل الهلام يقصد به إضافة العينات الى الهلام . في هذه الخطوة يتم نزع المشط حتى تكشف الثقوب. ومن ثم يتم نقل كل عينة في واحد من الثقوب أو الأبار بحيث يكون أساسا داخل الهلام نفسه. صبغة التحميل التي تم اضافتها مسبقا تحتوى هي ايضا على سكر مما يجعل المحلول كثيفًا الى حد ما؛ وهذا بدوره يجعل العملية سهلة.  4)تشغيل الهلام (تعريضه لمجال كهربائي) يقصد بتشغيل الهلام تعريضه لمجال كهربائي. عادةً ما يوضع جيل الاغاروز  في حدود 20 إلى 100 فولت (أعلى من 100 فولت يمكن أن يتسبب في ذوبان الهلام نتيجة الحرارة المتولدة). كلما زاد التيار زادت سرعة هجرة الجزيئات وبالتالي زادت سرعة تحليل النتائج. ومع ذلك ، فكلما كانت الهجرة أبطأ ، كان الحصول على نتائج واضحة أسهل. عادة ما يتم تشغيل هلام الحتى تهاجر الصبغة الى منتصف الطريق تقريبً من الثقوب أو الآبار حتى نهاية الجل 5) صبغ الجل او الهلام يشير صبغ الهلام إلى صبغ جزيئات الحمض النووي حتى نتمكن من تحديد إلى أي مدى هاجروا من الأصل (الآبار).  صبغة بروميد الاثيديوم هو الأكثر شيوعا في الاستخدام. سوف تلتصق الصبغة بالحمض النووي وستظهر الخطوط على الجل أينما يوجد DNA. بمجرد صبغها يمكن تحليل الجل. ملحوظة: تختلف الصبغة هنا عن الصبغة في  الخطوة رقم 2 التي لم تربط الحمض النووي ، إنها موجودة عبر الهلام حتى نتمكن من مراقبة التقدم. بمجرد تشغيل الجل وصبغه، يمكن تحليله. يشمل التحليل تحديد الطول بالنيوكليوتيدات لجزيء (جزيئات) الحمض النووي في العينة. ويتم ذلك من خلال قياس المسافة التي انتقل خلالها كل جزيء عبر الهلام  فهذه المسافة دالة على طول الجزيء ؛ فكلما كانت الجزيئات أصغر (أقصر) سوف تهاجر أبعد من الجزيئات الأطول.