شرح Western Blot : المفهوم، مراحل التنفيذ، وأهم التطبيقات

لطخة ويسترن هى تقنية لا يمكن الإستغناء عنها بأي حالٍ من الأحوال داخل مختبرات الطب الحيوي، وكذلك العديد من المختبرات والمعامل فى مختلف تخصصات البيولوجيا. وغالباً ما يتم إستخدام هذه التقنية بشكل أساسى فى الأغراض البحثية، فعلى سبيل المثال تستخدم بشكل أساسى داخل مختبرات التجارب الطبية السريرية.

من خلال هذه المقال سوف نتناول شرح Western Blot و نلقى الضوء على أساسيات وطريقة عمل لطخة ويسترن وأهم تطبيقاتها.

الغرض الأساسي من إجراء تجربة لطخة ويسترن هو الكشف عن بروتين محدد داخل العينة التى تحتوى على بروتينات مختلفة، كما أنها تزودنا بالكثير من المعلومات التفصيلية حول حجم هذا البروتين ووفرته النسبية داخل العينة المراد فحصها. كما يتم تسمية لطخة ويسترن ببعض المسميات الأخرى كـ “اللطخة المناعية” وتسمى بالإنجليزية Western blot أو Western blotting.

 

قم بتجربه ويسترن بلوت فى مختبر براكسيلابس الافتراضي الان

 

 

ويمكن تعريف لطخة ويسترن على أنها تقنية تحليلية يتم الإعتماد عليها بشكل أساسى فى مجالات البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة المناعي، حيث يتم استخدام “الأجسام المضادة” لتحديد “مولد الضد” الخاص بها. 

ويرجع تأسيس فكرة اللطخات الخاصة بالبروتينات إلى العالم “هاري توبين”. حيث أنه في عام 1978 قد قام “هاري توبين” بالإلتحاق بـ “معهد فريدريك ميسشر” في مدينة “بازل” كباحث بعد حصوله على درجة الدكتوراة، وذلك ضمن فريق علمي يرأسه “جوليان جوردون”.

وأثناء عمل “هاري” و “جوليان” على مشروعهما البحثي قاما بالتواصل مع “ثيو ستايهلين” وهو أحد أهم الرواد فى مجال دراسة البروتينات. 

وفى عام 1979 قام ثلاثتهم بنشر ورقة بحثية تحت عنوان “Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications.” وكانت هذه الورقة هي الحجر الأساسي الذى أعتمدت عليه تقنيات لطخات البروتينات بمختلف أنواعها التى سوف نتطرق إليها فى نبذات مختصرة.

جرب نسختك المجانية من معمل البايولوجيا الافتراضي من براكسيلابس لتنفيذ التجارب المعملية أونلاين.

 

وقبل أن نستكمل نقاشنا حول الأساسيات التى تقوم عليها لطخة ويسترن وتطبيقاتها، سوف نحتاج أولاً إلى توضيح بعض المصطلحات الخاصة بـ لطخات مشابهة لمصطلح لطخة ويسترن، مثل اللطخة الجنوبية واللطخة الشمالية واللطخة الشرقية.

southern blotting بالعربي

هناك بعض الأنواع الأخرى من اللطخات مثل الطخة الجنوبية وهي تقنية تستخدم في البيولوجيا الجزيئية لاكتشاف الحمض النووي منقوص الأكسجين DNA في عينة  معينة. وهي تدمج بين عملية نقل جزيئات الحمض النووي المفصول كهربائيا إلى غشاء و يتم الكشف عن هذه الاجزاء من خلال قطعة من الحمض النووي المهجنة (probe ). تسمى هذه الطريقة نسبة إلى مخترعها، عالم الاحياء ايدوان ساذرن. 

وهناك اللطخة الشمالية وهي طريقة اكتشاف الحمض النووي الريبوزي RNA. أما اللطخة الشرقية فهى تعتبر إمتداد لتطبيقات الكيمياء الحيوية الخاصة بلطخة ويسترن فهى تستخدم للكشف عن السكريات.

western blotting بالعربي

أساسيات تجربة لطخة ويسترن

لطخة ويسترن هي تقنية حيوية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة بروتين معين فى عينة تحتوى على انواع أخرى من البروتينات. حيث يتم استخراج البروتينات من العينة، وبعد ذلك يتم تصنيفها طبقاً إلى الوزن الجزيئي لكلٍ منها، وذلك باستخدام الفصل الكهربائى الهلامي.

بعد ذلك تنتقل البروتينات كهربائياً لتستقر على سطح أكثر متانة وهو غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيليدين، وهذه العملية تسمى بعملية التلطيخ.

فى النهاية يتم استخدام جسيمات مضادة معينة فى تحديد البروتين المستهدف، وبعد ذلك يمكن أن يتم تصوير البروتين المفصول لدراسته بشكل أكثر دقة، كما يتم تحديد وزنه الجزيئي وكثافة تواجده فى العينة.

هذا الفيديو مقدم من براكسيلابس لتطوير معامل العلوم الإفتراضية. يمكنك أيضًا قراءة هذا المقال الذي يحتوى على كل ماتريد ان تعرفه عن المعامل الافتراضية.

blotting techniques شرح بالعربي 

الان سنشرح خطوات تنفيذ لطخة ويسترن 

المقدمة

كما ذكرنا سابقاً فإن أول من اقترح تقنية لطخة ويسترن كان “هاري توبين” وذلك عام 1979، حيث تقوم الفكرة الرئيسية للتقنية على اكتشاف وفصل وتحليل بروتين معين داخل العينة المراد تحليلها.

حيث انه من الإمكان تصوير البروتينات المستهدفة ودراستها دراسة تفصيلية بعد فصلها عن المادة الهلامية، وذلك باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي وانتقالهم إلى الغشاء. 

فبعد تجهيز العينة يتم وضعها على المادة الهلامية ثم تبدأ عملية الفصل الكهربائي الهلامي وهو ما يسمح للبروتينات التي تحمل شحنة سالبة بالانتقال إلى القطب الموجب للبطارية.

بعد ذلك تنتقل البروتينات من المادة الهلامية إلى الغشاء حتى يمكن تحليلها بشكل اكثر دقة وهذه المرحلة هي المسماة بالتلطيخ، وحتى يتم منع أى تفاعل بين الغشاء والبروتينات غير المستهدفة يجب أن يتم سده. ويتم بعد ذلك تحديد وتصوير البروتينات المراد تحليلها. 

ويمكن تقدير حجم البروتين إعتماداً على بعض السوائل التى يتم إضافتها كعلامة فى السائل الهلامي، والحجم ليس العامل الوحيد لفصل البروتينات حيث يمكن الفصل إعتماداً على الشحنة الجزيئية أو درجة التمسخ.

 

ابدا تجربتك المعمليه عبر الانترنت الان!

 

ونتائج لطخة ويسترن تعتمد على ثلاثة عوامل مهمة هي:

أ- قابلية الاجسام المضادة للالتصاق ببروتين معين.

ب- قوة التفاعل.

ج- تركيز البروتين نفسه.

هذا بالاضافة الى أخرى مثل نوعية الالتصاق بالبروتين المستهدف، وانخفاض التفاعلية المتصالبة، فهذين العاملين يؤثران أيضاً في جودة النتائج.

ويجب ملاحظة أنه ليس من السهل دائماً تفسير نتائج لطخة ويسترن، حيث ان الحجم من الممكن أن يختلف عن الحجم النظري للبروتين نتيجة لتعديل ما بعد الترجمة -كالارتباط بالجليكوزيل- أو نتيجة التفاعل مع البروتينات الأخرى.

والجدير بالذكر أن لطخة ويسترن هي طريقة شائعة، ويتم التأكد من فاعلية معظم المضادات الحيوية التجارية من خلالها.

تجهيز العينة

الخطوة الأولى فى التجربة هي تجهيز العينة ووضعها فى المادة الهلامية، وقد تكون العينة عبارة عن نسيج حيوي او خلية او سائل المراد استخراج بروتين معين منه ودراسته.

يتم كسر الأنسجى باستخدام خلاط او مجنس او عن طريق الصوتنة، ثم يتم إضافة محلول منظم ومثبطات لتشجيع التكسير وإذابة البروتينات ومنع تآكل العينة بسبب انزيماتها الخاصة.

كما يمكن استخدام التقنيات الميكانيكية والكيمياء الحيوية (البايوكيميائية) كالعديد من أنواع التصفية والطرد المركزي لفصل أجزاء أو عضيات معينة من الخلايا.

ويجب الأخذ فى الاعتبار أن تحديد التركيز الكلي للبروتينات التى تم استخراجها هو أمر ضرورى حتى تتمكن من مقارنة العينات ببعضها البعض. 

الفصل الكهربائي الهلامي

الفصل الكهربائى الهلامي هو عملية فصل البروتينات حسب خواص معينة على الهلام باستدراج البروتينات نحو أقطاب كهربائية تساعد على فصل البروتينات المعينة ضمن الهلام تحضيراً لاستخدامات أخرى.

فبعد أن تكون العينة جاهزة للتحميل على الهلام لفصل البروتينات حسب الحجم يتم توليد مجال كهربي أعلى الهلام حتى يتم فصل العينات المشحونة.

وهذه الطريقة تسمى الرحلان الكهربائي باستخدام عديد الأكريلاميد (PAGE) وهي تقنية تستخدم على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية والكيمياء الشرعية والطب الوراثي والبيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية لفصل الجزيئات البيولوجية، عادةً تكون البروتينات أو الأحماض النووية، وفقًا للرحلان الكهربائي.

وتوفر عملية الرحلان الكهربائي باستخدام عديد الأكريلاميد معلومات قيمة حول كتلة وشحنة وفرصة تواجد البروتين.

وتستخدم الهلامات متعددة الأكريلامايد polyacrylamide ومحاليل تحتوي على كبريتات دوديكل الصوديوم Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) لتنفيذ عملية الفصل الكهربي.

ويكون الدور الأساسى لكبريتات دوديكل الصوديوم هو الحفاظ على سلسلة البروتينات في حالة مفككة حتى تتم عملية المعالجة ومن ثم فصل البروتينات حسب وزنهم الجزيئي. 

كما تستخدم كبريتات دوديكل الصوديوم السالبة الشحنة لتغطية البروتينات فى العينة ومن قم يتم نقلها إلى القطب الكهربائي الموجب الشحنة خلال شبكة الأكريلامايد في الهلام. 

وتتناسب سرعة انتقال البروتينات مع أحجامها، حيث تنتقل البروتينات الصغيرة أسرع خلال هذه الشبكة وبذلك يتم فصل البروتينات حسب الحجم. كما يتناسب تركيز الأكريلامايد مع دقة البروتينات فكلما زاد تركيز الأكريلامايد كلما زادت دقة البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية. 

ويتم تحميل العينات في آبار داخل الهلام. وعندما يتم تطبيق فرق الجهد على الهلام، تبدأ البروتينات فى الانتقال خلاله ضمنه بسرعات مختلفة. 

نقل البروتينات إلى الغشاء

بعد إتمام مرحلة الفصل الكهربائى للهلام سوف ننتقل إلى المرحلة التالية وهى نقل البروتين إلى غشاء أكثر متانة. فى هذه الخطوة سوف نحتاج إلى إسفنج وورق ترشيح ومادة هلامية وغشاء بتم وضعه بين المادة الهلامية و القطب الموجب للبطارية.

تساعد هذه المرحلة على تسهيل عملية الوصول للبروتينات والاكتشاف بالأجسام المضادة، حيث يتم نقلهم من الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF. 

وبعد ان يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلام ووضع مجموعة من طبقات أوراق الترشيح فوقهم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى الأعلى عبر الأوراق بالخاصية الشعرية Capillary action، جالباً البروتينات معه إلى الغشاء.

كما يوجد بعض الوسائل الاخرى لتنفيذ عملية نقل البروتينات و تدعى اللطخة الكهربائية، حيث يتم استخدام تيار كهربائي لسحب البروتينات من الهلام إلى الغشاء.

الآن وبعد ان تم نقل البروتينات من داخل الهلام إلى سطح الغشاء من النيتروسيليلوز أو PVDF مع ثبات الرتيب التى كانت موجودة طبقاً له داخل الهلام، أصبحت البروتينات الآن معروضة بشكل واضح على سطح رقيق قابلة للاكتشاف والتحليل. 

ويجب التنويه هنا إلى أن نوعي الغشاء سواءاً كان نيتروسيليلوز أو PVDF يتملكان خاصية خاصية الالتصاق بأى بروتين بشكل متساوي (مما يعني انهما يلتصقان بالبروتينات المستهدفة وغير المستهدفة على حد سواء). 

ويكون التصاق البروتينات مبني على hydrophobic interactions، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. الجدير بالذكر أن أغشية النيتروسيليلوز تكون أقل كلفة من الـ PVDF، ولكنها هشة أكثر.

ابدا تجاربك مع براكسيلابس الان مجانا!

 

مرحلة السد

بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته للالتصاق بالبروتينات، وحيث أن كلاً من الأجسام المضادة والبروتينات المستهدفة هي عبارة عن بروتينات، لذلك من الضرورى أخذ بعض الاحتياطات لتجنب التفاعل بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين المستهدف. 

يتم منع الالتصاق بالبروتينات غير المستهدفة عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين، وعادة ما يكون هذا البروتين هو ألبومين مصل البقر Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA أو حليب من غير دهون وتتميز المادتين بانهم قليلي التكلفة، ويضاف إليهم كميات صغيرة من منظف مثل توين 20 Tween. 

البروتين الموجود في المحلول المخفف يؤدي لحدوث عملية الإلتصاق بالغشاء في الأماكن التى لا تحتوي على البروتينات المستهدفة.

ولذلك بعد إضافة الجسم المضاد، سوف يلتصق بالاماكن التى يوجد بها البروتين المستهدف مباشرة فلن يكون هناك مكان اخر له ليلتصق به. وهذا يؤدي الى تقليل نسبة الخطأ في النتائج النهائية للطخة ويسترن، وتكون النتائج ذات جودة أعلى وبالتالى أكثر وضوحاً.

الاكتشاف

فى اثناء عملية الاكتشاف، نقوم بالتحقق من وجود البروتينات المطلوبة على الغشاء وذلك باستخدام جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، والذي يسبب تفاعل لوني عند وضع مادة معينة عليه عند وضع مادة معينة عليه وينتوج لون معين. وينقسم تنفيذ هذه الخطوة إلى مرحلتين.

المرحلة الأولى: الجسم المضاد الأولي

يتم تكوين الأجسام المضادة عندما يتم عرض البروتين المطلوب (أو جزءاً منه) على المستضيف أو خلايا المناعة المزروعة. عادةً، يكون هذا جزءاً من الاستجابة المناعية، ولكن هنا يتم حصد الأجسام المضادة واستخدامها كأدوات اكتشاف دقيقة وحساسة تلتصق بالبروتين مباشرة.

فبعد تنفيذ عملية السد، يتم احتضان الغشاء الموجود فى  المحلول المخفف من قِبل الجسم المضاد الأولي مع التحريك الخفيف. ويحتوي المحلول المخفف على محاليل ملحية مع نسبة صغيرة من المنظفات، وأحياناً مسحوق حليب أو ألبومين مصل البقر BSA. 

يمكن وضع محلول الجسم المضاد والغشاء معاً واحتضانهم لفترة محددة. ويمكن أيضاً احتضانهم في درجات حرارة مختلفة، حيث تكون الدرجات الدافئة أكثر محفزة على الالتصاق.

 

المرحلة الثانية: الجسم المضاد الثانوي

بعد تنقيع الغشاء أو غسله بهدف إزالة الأجسام المضادة الأولية الغير ملتصقة، نقوم بإضافة جسم مضاد آخر للغشاء وهو الجسم المضاد الثانوي، ويتم توجيه هذا الجسم المضاد الثانوي باتجاه جزء خاص لنوع الجسم المضاد الأولي. وبسبب خواصه المستهدِفة، يتم تسميته بـ”ضد الفأر”، “ضد العنز”، “ضد الجرذ”، الخ. 

الأجسام المضادة تأتي من مصادر الحيوانات، ولذلك فإن الجسم المضاد الثانوي ضد الفأر سيلتصق بأي جسم مضاد أولي مصدره الفأر. وهذا يسمح لتوفير المصاريف بالسماح لكل المختبر من استخدام مصدر واحد من جسم مضاد منتج بكثرة، ويوفر نتائج منسقة أكثر بكثير. 

ويتم إكتشاف البروتين على الغشاء بطرق مختلفة (chemiluminescence, chemifluorescence, fluorescence, chromogenic, or radioisotopic detection)

وبين كل هذه الطرق فإن الطريقة الأكثر إستخداماً هي الإضاءة الكيميائية Chemiluminescence.

تعتمد طريقة الاكتشاف بالإضاءة الكيميائية على احتضان لطخة ويسترن مع المادة التي تضيء عندما تتصل بالجزئ المراسل على الجسم المضاد الثانوي. وبعد ذلك يتم تجميع الضوء عن طريق فيلم فوتوغرافي أو باستخدام كاميرات سي سي دي CCD cameras والتى تلتقط صورة رقمية للطخة ويسترن. ثم نقوم بتحليل هذه الصورة باستخدام مقياس الكثافة الذي يحلل كمية الصبغة البروتينية النسبية ويقوم بالتحليل الكمي عن طريق الكثافة الضوئية. 

ويوجد  العديد من البرامج الجديدة التى تساعدنا فى عملية تحليل البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى بالمضيء الكيميائي المحسن Enhanced chemiluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.

كما يتم أحياناً استخدام طريقة الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection حيث يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة مسقبلات ضوئية مثل كاميرات السي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب.

حيث تقوم تلك الكاميرات باستقبال الضوء المنبعث وألتقاط صورة رقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن. 

يعتبر الملتقط الفلوري من بين أكثر الطُرق حساسية لتحليل اللطخة.

قم باختبار تجربه ويسترن بلوت الان مجانا

 

مرحلة التحليل

الاشارات التى يتم استقبالها باستخدام الفيلم الفوتوغرافي او الكاميرات تتسبب فى تكوين مجموعة نطاقات من البروتينات على الغشاء. ويمكن من خلالها تقدير الوزن الجزيئي للبروتينات كما يمكن تحديد كمياتها.

تطبيقات لطخة ويسترن

وهناك العديد من التطبيقات المتنوعة والمختلفة للطخة ويسترن والتى تستخدم بشكل واسع فى المجالات الطبية والعلمية. حيث أنها تساعد على تحديد وجود بروتين معين، كما تساعد على دراسة وفهم كيف تتعامل البروتينات فى بعض الفيروسات مع الادوية.

وتعتبر لطخة ويسترن وسيلة لتأكيد النتائج الخاصة بتحليلات الامراض، فعلى سبيل المثال تستخدم بشكل اسا.ى لتأكيد نتائج الاصابة بمرض نقص المناعة (الإيدز).

تحليل ويسترن بلوت

تم اختراع تحليل ويسترن بلوت في عام 1979 لهدف تحديد بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الريبوزومي.

يتم عمل تحليل لطخة ويسترن في حالة الحصول على نتيجة إيجابية لداء لايم أو فيروس نقص المناعة البشرية، فقد يوصي الطبيبب باختبار لطخة ويسترن بعد اجراء تحليل اليسا (ELISA)

يبحث تحليل ويسترن بلوت عن الأجسام المضادة للعدوى، وليس العدوى نفسها، فعند اصابة الجسم بعدوى فيروسية أو فطرية أو بكتيرية ، فإنه سينتج بروتينات تسمى المستضدات استجابةً لذلك. تحفز المستضدات جهاز المناعة لطرد الأجسام المضادة في محاولة لمكافحة المرض.

يمكنك القراءة أيضًا عن تحليل PCR : وسيلة الكشف عن عدوى كورونا الجديد COVID-19

نفذ تجربة  شرح western blot الآن

يمكنك الآن إجراء تجربة شرح western blot  عن طريق موقعنا على الانترنت، سجل الآن على موقع براكسيلابس.

تقدم براكسيلابس معامل العلوم الإفتراضية التى تمكنك من إجراء العديد من التجارب فى العلمية فى الكيمياء والفيزياء والبايولوجيا عبر الانترنت فى اى وقت ومكان.

ابدا تجربتك المعمليه عبر الانترنت الان!!