الفصل الكهربائي الهلامي|المفهوم، الخطوات، المعدات،والتطبيقات

الفصل الكهربائي الهلامي – والذي يعرف أيضا بالهجرة الكهربائية الهلامية أو الترحيل الكهربائي للهلام – هو واحد من أشهر التقنيات المستخدمة في فصل جزيئات الحمض النووي DNA أو RNA أو البرتينات. وللفصل الكهربائي الهلامي تطبيقات كثيرة هامة جدا سنتناولها في هذا المقال.

ماهو مفهوم الفصل الكهربائي الهلامي؟

يُعرف مفهوم الفصل الكهربائي الهلامي على انه طريقة معملية تستخدم لفصل خليط من الحمض النووي DNAأو RNA أو البروتينات وفقًا للحجم الجزيئي والشحنة الكهربائية.

في الرحلان الكهربائي الهلامي، يتم وضع أو دفع الجزيئات المراد فصلها بواسطة مجال كهربائي عبر مادة هلامية (جيل)تحتوي على مسام صغيرة. تنتقل الجزيئات عبر مسام الهلام بسرعة ترتبط عكسياً بأطوالها. هذا يعني أن جزيء DNA الصغير سوف ينتقل عبر الهلام أو الجيل مسافة أكبر من جزيء DNA الأكبر.

يتضمن الرحلان او الفصل الكهربائي الهلامي مجال كهربائي، يتم تطبيق هذا المجال بحيث يكون لأحد طرفي الهلام شحنة موجبة والطرف الآخر له شحنة سالبة؛ فعلى سبيل المثال نظرًا لأن DNA و RNA جزيئات سالبة الشحنة، فسيتم سحبها نحو النهاية الموجبة الشحنة من الهلام.

أما البروتينات فهي ليست سالبة الشحنة؛ لذلك عندما يراد فصل البروتينات باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي، يجب أولاً خلط البروتينات بمنظف يسمى كبريتات دوديسيل الصوديوم sodium dodecyl sulfate. يجعل هذا العلاج البروتينات تتكشف وتظهر في شكل خطي وتغطيها بشحنة سالبة ، مما يسمح لها بالانتقال نحو النهاية الموجبة للهلام أو للجيل ومن ثم الفصل.

أخيرًا، بعد فصل جزيئات الحمض النووي DNA  أو RNA أو البروتين باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي ، يمكن اكتشاف الحزم Bands التي تمثل جزيئات ذات أحجام مختلفة.

ماهى العوامل التي تتحكم بحركة جزيئات الحمض النووي ـ DNA في الهلام  أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟

• الشحنة.
• الجحم الجزيئي لشريط الحمض النووي (الجزيئات ذات الحجم الجزيئي الأصغر تتحرك أسرع من الجزيئات ذات الحجم الجزيئي الأكبر)
• تركيز هلام الاغاروز (عادة 0.8٪).
• تشكيل الحمض النووي (خطي / بلازميد / إلخ ..).
• قوة التيار الكهربي المستخدم .
• حجم الثقوب (الثقوب الصغيرة مناسبة لفصل الجزيئات الصغيرة والثقوب الكبيرة مناسبة لفصل الجزيئات الكبيرة)
• صبغة بروميد الإيثيديوم:  موجب الشحنة ؛ لذلك يقلل من معدل هجرة الحمض النووي بنسبة 15٪. تشمل الصبغات الأخرى للحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز SYBR Gold و SYBR green و Crystal Violet و Methyl Blue.

المادة الهلامية 

يتضمن الفصل الكهربائي للهلام مادة هلامية أو جيل هو عبارة عن لوح من مادة عادة ما يتم تصنيعها من الاجاروس agarose (وهو عديد السكاريد polysaccharides)، ويكون  على شكل رقائق جافة ومطحونة. عندما يتم تسخين الاجاروس في محلول ماء به بعض الأملاح  ويترك ليبرد، فإنه يكون مادة هلامية صلبة لكن هشة قليلاً.

 والمادة الهلامية عبارة عن مصفوفة من جزيئات الاجاروس agarose التي ترتبط ببعضها البعض من خلال روابط هيدروجينية وتشكل مسامًا صغيرة.

في أحد طرفي اللوح يحتوي الجل او الهلام على فجوات أو فتحات تسمى الآبار، يتم وضع العينات فيها.

ملحوظة: يتم استخلاص الاجاروس من الأعشاب البحرية Gelidium و Gracilaria.

براكسيلابس هي منصة تعليمية تتيح لك مجموعة من المعامل افتراضية التفاعلية في أي وقت و أي مكان بتكلفةمناسبة  .. أنشئ حسابك الآن واستكشف عالم افتراضي للعلوم بين يديك! 

ماهى طريقة الفصل الكهربائي الهلامي

هناك عدة خطوات أساسية لطريقة الفصل الكهربائي الهلامي، وهي:

1) صب وتحضير الهلام

لتحضير هلام الأغاروز  Agarose ، نقوم بغلي عينة عادة ما تكون بتركيز 1% Agarose، وبعد الغليان يُصب في قالب ويترك ليبرد. بعد أن يبرد، سوف يتجمد في  شكل مصفوفة وعندما يصب الجل في القالب ، يتم وضع المشط داخل القالب في أحد طرفيه و لذلك الهلام يحتوي على عدة  ثقوب أو آبار.

 2) تحضير العينات

يقصد بتحضير العينة أن تضيف صبغة تحميل إلى عينة الحمض النووي. الغرض من صبغة التحميل هو السماح بتصوير هجرة العينات خلال الهلام، فبالرغم من عدم قدرتنا على رؤية جزيئات الحمض النووي نفسها لكن يمكننا مراقبة التقدم من خلال مراقبة الى أي مدى الصبغة (ذات الشحن السالبة ) قد انتقلت.

ملحوظة: الصبغة الأكثر شيوعًا هي البروموفينول الأزرق التي تنتقل من خلال الهلام بنفس معدل جزيء DNA الذي يبلغ 300 نيوكليوتيد في الطول.

 3) تحميل الهلام

يقصد به إضافة العينات الى الهلام . في هذه الخطوة يتم نزع المشط حتى تكشف الثقوب. ومن ثم يتم نقل كل عينة في واحد من الثقوب أو الأبار بحيث يكون أساسا داخل الهلام نفسه.

صبغة التحميل التي تم اضافتها مسبقا تحتوى هي ايضا على سكر مما يجعل المحلول كثيفًا الى حد ما؛ وهذا بدوره يجعل العملية سهلة.

 4)تشغيل الهلام (تعريضه لمجال كهربائي)

يقصد بتشغيل الهلام تعريضه لمجال كهربائي. عادةً ما يوضع جيل الاغاروز  في حدود 20 إلى 100 فولت (أعلى من 100 فولت يمكن أن يتسبب في ذوبان الهلام نتيجة الحرارة المتولدة).

كلما زاد التيار زادت سرعة هجرة الجزيئات وبالتالي زادت سرعة تحليل النتائج. ومع ذلك ، فكلما كانت الهجرة أبطأ ، كان الحصول على نتائج واضحة أسهل.

عادة ما يتم تشغيل هلام الحتى تهاجر الصبغة الى منتصف الطريق تقريبً من الثقوب أو الآبار حتى نهاية الجل

5) صبغ الجل او الهلام

يشير صبغ الهلام إلى صبغ جزيئات الحمض النووي حتى نتمكن من تحديد إلى أي مدى هاجروا من الأصل (الآبار).  صبغة بروميد الاثيديوم هو الأكثر شيوعا في الاستخدام. سوف تلتصق الصبغة بالحمض النووي وستظهر الخطوط على الجل أينما يوجد DNA. بمجرد صبغها يمكن تحليل الجل.

ملحوظة: تختلف الصبغة هنا عن الصبغة في  الخطوة رقم 2 التي لم تربط الحمض النووي ، إنها موجودة عبر الهلام حتى نتمكن من مراقبة التقدم.

بمجرد تشغيل الجل وصبغه، يمكن تحليله. يشمل التحليل تحديد الطول بالنيوكليوتيدات لجزيء (جزيئات) الحمض النووي في العينة. ويتم ذلك من خلال قياس المسافة التي انتقل خلالها كل جزيء عبر الهلام  فهذه المسافة دالة على طول الجزيء ؛ فكلما كانت الجزيئات أصغر (أقصر) سوف تهاجر أبعد من الجزيئات الأطول.

فيديو يوضح خطوات الفصل الكهربائي الهلامي

معدات الرحلان الكهربائي الهلامي

يتكون جهاز الرحلان الكهربي للهلام من مادة هلامية ، والتي غالبًا ما تُصنع من أجار أو بولي أكريلاميد ، وحجرة (عادةً صندوق أو خزان بلاستيكي صلب) مع كاثود (طرف سالب) في أحد طرفيه وأنود (طرف موجب) عند الطرف.

في النهاية المقابلة. يتم وضع الجل أوالهلام ، الذي يحتوي على مجموعة من الفتحات او الآبار في نهاية الطرف السالب، داخل الحجرة ومغطى بمحلول للعزل. بعد ذلك يتم وضع العينات في الفتحات باستخدام الماصة.

الحجرة  متصلة بمصدر طاقة ، عند تشغيله ، يطبق مجالًا كهربائيًا على الحجرة. يتسبب المجال الكهربائي في انتقال الجزيئات سالبة الشحنة عبر الهلام نحو القطب الموجب. (الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA مشحونان بشحنة سالبة بعد المعالجة) كما تتأثر الجزيئات وحركتها بمصفوفة الهلام المسامية بحيث تتحرك الجزيئات الأثقل والأكبر بشكل بطيئ نسبيًا ، بينما تتحرك الجزيئات الأخف وزنًا والأصغر حجما بسرعة أكبر.

تؤثر نوع المادة المستخدمة في تصنيع الهلام و كثافة المسام على معدل حركة الجزيئات. غالبًا ما يتم تشغيل “سلم” مصبوغ ، أو علامة متعددة الجزيئات لها أوزان جزيئية متغيرة ومعروفة  مع عينات تجريبية لتكون مثل مرجع للحجم.

 دور الصبغة هنا هو اتاحة تصوير العلامة أثناء تحركها خلال الهلام ؛ عادة ما تكون العينات مصبوغة أيضًا للتصوير. تُستخدم صبغة معروفة باسم بروميد إيثيديوم ، والتي تلمع تحت الضوء فوق البنفسجي ،لتصوير واضح لعينات الحمض النووي.

يوضح الشكل التالي أهم المعدات المستخدمة في تقنية الهجرة الكهربائية (معدات الرحلان الكهربائي الهلامي

)

سجل فى مختبر براكسيلابس الافتراضي الان

تطبيقات الفصل الكهربائي الهلامي

تكمن اهمية تقنية الهجرة الكهربائية في امكانية استخدامها في مجالاتى الطب الشرعي والبيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة والميكروبيولوجي والكيمياء الحيوية.

• أشهر تطبيقات الفصل الكهربائي الهلامي هي عملية فصل الحمض النووي DNA بهدف:

التحقق من التضخيم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعلات التسلسل.

تصور مجموعات من العلامات الجزيئية لتحديد التركيب الوراثي للنباتات .

التحقق من جودة وكمية الحمض النووي الجيني بعد استخلاص الحمض النووي.

الحصول على قطع منفصلة من الحمض النووي لاستنساخ قطع معينة.

 فصل قطع من الحمض النووي لأخذ البصمات للتحقيق في مسرح الجريمة.

تحليل الجينات المرتبطة بمرض معين.

في تحديد سمات الحمض النووي لدراسات التصنيف للتمييز بين الأنواع المختلفة.

في اختبار الأبوة باستخدام بصمة الحمض النووي.

في دراسة بنية ووظيفة البروتينات.

في تحليل مقاومة المضادات الحيوية.

في دراسة العلاقات التطورية من خلال تحليل التشابه الجيني بين السكان أو الأنواع.

• تُستخدم تقنية الهجرة الكهربائية الهلامية أيضًا في الصناعات مثل علوم الأغذية؛ فمعظم الطعام يمكن فحص مكوناته بهذه التقنية (خاصة البروتينات والأيونات والأحماض العضوية والسكريات) وتحليلها بهدف صناعة الحفاظ على جودة المنتجات الغذائية.

• من تطبيقات الفصل الكهربي الهلامي الطبية أنه يمكن استخدامه للكشف عن الشوائب وتركيز المضادات الحيوية واللقاحات وكذلك تحديد جرعة المضادات الحيوية بدقة أكبر. ففي اللقاح ، يتم استخدامه لاختبار نقاوة وتركيز اللقاحات بمستويات مختلفة وأنواع الأجسام المضادة لإيجاد نسخة من اللقاح أفضل ما يمكن. كما أنها تستخدم للكشف عن وجود بروتين غير طبيعي كميا أو نوعا.

• كما يستخدم في تشخيص اعتلال الهيموغلوبين ، وتحديد المصل و التنميط الجيني للبروتين لتحليل ApoE لمرض الزهايمر (البروتين متعدد الأشكال) ، مراقبة الجزيئات الصغيرة (الأدوية ، المنشطات) ، تحليل السائل النخاعي ، وتحليل البول وغيرهم.

تجربة الفصل الكهربائي الهلامي من براكسيلابس