تفاعل البوليميراز المتسلسل:التعريف،الأساس العلمي، الأنواع، الخطوات، التطبيقات

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الآن تقنية شائعة ولا غنى عنها في كثير من الأحيان، فهو يستخدم في مختبرات الأبحاث الطبية والبيولوجية لمجموعة متنوعة من التطبيقات التي تشمل  استنساخ الحمض النووي للتسلسل، والتطور القائم على الحمض النووي، أو التحليل الوظيفي للجينات، وتشخيص الأمراض الوراثية، واكتشاف الأمراض المعدية وتشخيصها.

حول تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR

تم تطوير هذه التكنولوجيا بواسطة كاري موليس في عام 1993، حصل موليس على جائزة نوبل في الكيمياء مع مايكل سميث لعمله على تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR.

في عام 1989، اختارت مجلة Science تفاعل البوليميراز المتسلسل باعتباره “التطور العلمي الرئيسي” و إنزيم Taq polymerase الإنزيم الأساسي لنجاح PCR، باعتباره “جزيء العام”. كان ظهور تفاعل البوليميراز المتسلسل يعني أن أوجه القصور في كمية الحمض النووي لم تعد تحد من أبحاث البيولوجيا الجزيئية أو إجراءات التشخيص. الآن من الصعب بالفعل العثور على  أبحاث منشورة في العلوم البيولوجية لا تصف تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أو بأخر.

قم بتجربه تفاعل البوليميراز المتسلسل pcr فى معامل براكسيلابس الافتراضيه الان

 

ما هو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR )؟

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو عملية حيوية أو نظام يتم في أنبوب اختبار يهدف لتكرار الحمض النووي والذي يسمح بتضخيم تسلسل الحمض النووي “المستهدف” بشكل انتقائي عدة ملايين من الطيات في غضون ساعات قليلة. يحقق تفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيمًا لجزء محدد مسبقًا من الحمض النووي والذي يمكن أن يتراوح طوله على سبيل المثال من 100 إلى 1000 نقطة أساس)

 الأساس العلمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل PCR

مفهوم تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR بسيط ولكن تأثيره غير عادي. تعتمد الكيمياء المشاركة في تفاعل البوليميراز المتسلسل على التكامل (المطابقة) لقواعد النوكليوتيدات في حلزون الحمض النووي المزدوج الشريط. عندما يتم تسخين جزيء من الحمض النووي بشكل كافٍ، تتعطل الروابط الهيدروجينية التي تربط شريطي الحلزون المزدوج معًا وينفصل الجزيء أو يغير خصائصه إلى شرائط مفردة. و في حالة السماح لمحلول الحمض النووي بالتبريد، يمكن إصلاح أزواج القواعد التكميلية لاستعادة الحلزون المزدوج الأصلي.

ما هو الحد الأدنى من البيانات اللازمة قبل استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النموذجي؟

من أجل استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، يجب معرفة التسلسل الدقيق للنيوكليوتيدات التي تحيط (تقع على جانبي) المنطقة المستهدفة التي تحتاج إلى تضخيم. هذا هو الحد الأدنى المطلق من البيانات اللازمة قبل استخدام تفاعل PCR نموذجي.

هذه البيانات ضرورية لتصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يبلغ طولها 5-3 أليغنوكليوتيدات من حوالي 20 نيوكليوتيد. تم تصميم هذه لتكون مكملة للتسلسلات المرافقة للمنطقة المستهدفة كما ذكرنا سابقًا. وبالتالي، يتعين على الباحث استخدام البيانات السابقة (معلومات التسلسل المعروفة) أو إذا لم يكن ذلك متاحًا، فيمكن تحديد تسلسل هذه المناطق بشكل تجريبي و يمكن بعد ذلك تصنيع (البادئين) كيميائيًا، ثم يعملان كقادة أو مبادرين لخطوة النسخ المتماثل.

مفتاح تفاعل النسخ المتماثل هو أنه مشتق بواسطة جزيء بوليميراز مستقر للحرارة يقرأ قالب DNA في اتجاه 3-5 ويصنع قالبًا تكميليًا جديدًا في الاتجاه 5-3 باستخدام ثلاثي فوسفات ثنائي أكسيد النوكليوزيد أو يسمى أيضًا دي أوكسي نيوكليوتايد ثلاثي الفوسفات(dNTP’s = قواعد النوكليوتيدات) كوحدات بناء.

أنواع تفاعل البوليميراز المتسلسل

هناك الكثير من الأنواع التى تطورت من الطريقة الأصلية، حيث تم التعديل بعدة طرق للمساعدة فى دراسة وتحليل المادة الوراثية وكذلك ملائمة الغرض المطلوب من الدراسة. ومن هذه الأنواع:-

1	Traditional PCR	8	Colony PCR
2	Reverse Transcriptase PCR	9	Long PCR
3	Multiplex PCR	10	Long Accurate PCR
4	Real time PCR	11	Asymmetric PCR
5	Inverse PCR	12	Allele specific PCR
6	Nested PCR	13	In Situ PCR
7	Hot Start PCR	14	AFLP PCR

في هذا المقال نركز على فهم الطريقة الأساسية التقليدية.

 مكونات جهاز PCR تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسي

• اثنان من البادئات. 
• انزيم Taq polymerase.
• دي أوكسي نيوكليوتايد ثلاثي الفوسفات (dNTPs).
• محلول منظم.
• ماء مقطرة.
• قالب DNA.

خطوات تفاعل البلمرة المتسلسل الاساسي

PCR هي تقنية قوية تسمح بالتضخيم لتسلسل الحمض النووي. و يحتاج هذا التفاعل إلى زوج من البادئات المكملة للتسلسل المستهدف. يتم تمديد البادئات بواسطة انزيم DNA polymerase.

يتم إعادة تضخيم النُسخ التي تم إنتاجها بعد الامتداد، والتي تسمى الأمبليكون باستخدام نفس البادئات، مما يؤدي إلى تضخيم لجزيئات الحمض النووي. بعد التضخيم، يتم استخدام تقنية الفصل الكهربي gel electrophoresis لتحليل نواتج PCR المضخمة وهذا يجعل PCR التقليدي أو الاساسي يستهلك الكثير من الوقت، حيث يجب أن ينتهي التفاعل قبل متابعة تحليل ما بعد PCR.

يتغلب Real Time PCR على هذه المشكلة، نظرًا لقدرته على قياس الامبليكون في الحالات المبكرة للتفاعل حيث تتراكم في وضع “Real Time Detection”وبالتالي قياس كمية منتج PCR.

الخطوات الأساسية الثلاث لتفاعل البوليميراز المتسلسل

يعتمد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على ثلاث خطوات بسيطة مطلوبة لأي تفاعل لتخليق الحمض النووي:

(1) تمسخ القالب إلى شرائط مفردة.

(2) تلدين البادئات.

(3) تمديد خيوط DNA الجديدة من البادئات.

يمكن إجراء هذه التفاعلات مع أي انزيم DNA polymerase وتؤدي إلى تخليق أجزاء محددة من تسلسل DNA الأصلي. ومع ذلك، من أجل تحقيق أكثر من دورة واحدة من التخليق يجب تغيير طبيعة القوالب مرة أخرى الأمر الذي يتطلب درجات حرارة أعلى بكثير من تلك التي تعطل معظم الإنزيمات. لذلك، أجريت محاولات أولية لتخليق الحمض النووي الدوري عن طريق إضافة بوليميراز جديد بعد كل خطوة تمسخ . ولكن تصبح تكلفة مثل هذا البروتوكول باهظة بسرعة.

عادةً ما يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل من سلسلة من 20-40 تغيرًا متكررًا في درجات الحرارة، تسمى دورات وتتكون كل دورة عادةً من 2-3 خطوات ذات درجة حرارة منفصلة. غالبًا ما يسبق الدوران خطوة درجة حرارة واحدة عند درجة حرارة عالية (> 90 درجة مئوية) ويتبعها one hold في النهاية لتمديد المنتج النهائي أو تخزين قصير. تعتمد درجات الحرارة المستخدمة وطول الفترة الزمنية المطبقة في كل دورة على مجموعة متنوعة من المعلومات. وتشمل هذه الإنزيم المستخدم في تخليق الحمض النووي، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ و dNTPs في التفاعل ودرجة حرارة انصهار المواد الأولية.

 

ابدا تجربتك الان فى معامل براكسيلابس ثلاثيه الابعاد!

 

 

الآن سوف نعرف ماذا يحدث في كل مرحلة من مراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل

خطوة التهيئة

• مطلوب فقط لبوليميرات الحمض النووي التي تتطلب تنشيطًا حراريًا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الساخن.
• تتكون هذه الخطوة من تسخين التفاعل إلى درجة حرارة 94-96 درجة مئوية (أو 98 درجة مئوية إذا تم استخدام بوليميرات شديدة الثبات الحراري) من 1 إلى 9 دقائق.

خطوة التمسخ Denaturation

هذه الخطوة هي أول حدث دوري منتظم وتتكون من تسخين التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية. يتسبب في الذوبان  لقالب الحمض النووي عن طريق تعطيل الروابط الهيدروجينية بين القواعد التكميلية، مما ينتج عنه جزيئات DNA أحادية الشريط.

خطوة التلدين Annealing

تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى 50-65 درجة مئوية لمدة 20-40 ثانية مما يسمح بتصلب البادئات إلى قالب DNA أحادي الشريط

خطوة التمديد / الاستطالة Extension

تعتمد درجة الحرارة في هذه الخطوة على انزيم DNA بوليميراز ا المستخدم .

 انزيم  Taq polymerase تكون درجة حرارة نشاطه المُثلى عند 75-80 درجة مئوية وعادة ما يتم استخدام درجة حرارة 72 درجة مئوية مع هذا الإنزيم. في هذه الخطوة، يقوم انزيم DNA بوليميراز بتركيب شريط DNA جديد مكمل لقالب الحمض النووي عن طريق إضافة dNTPs المكملة للقالب في اتجاه 5 ‘إلى 3’، مما يؤدي إلى تكثيف مجموعة الفوسفات  5′-phosphate من dNTPs مع 3’- مجموعة الهيدروكسيل في نهاية شريط DNA الناشئ (الممتد). يعتمد وقت التمديد على انزيم DNA بوليميراز المستخدم وعلى طول جزء الحمض النووي للتضخيم.

 

توفر معامل براكسيلابس الافتراضية مُحاكاة ثلاثية الأبعاد لتجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR، حيث يمكنك إجراء التجربة في معمل البيولوجيا الافتراضي، والذي يوفر لطلاب العلوم والأساتذة فهمًا أكثر دقة للتجربة وخطواتها. 

تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR

بسبب الدقة والحساسية الكبيرة لهذه التقنية، اكتسب PCR شعبية كبيرة في مجموعة واسعة من التطبيقات مثل:-

• يستخدم علماء البيولوجيا الجزيئية تفاعل البوليميراز المتسلسل في استنساخ الجينات وتسلسل الحمض النووي.
• يعد الاستنساخ الخلوي أحد أكثر تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل تميزًا. يجعل من الممكن عزل الجين، أي لتنقية الجين دون اللجوء إلى الأساليب التقليدية للاستنساخ الجزيئي والتي تتمثل في إدخال مكتبة DNA في ناقل بلازميد يتم استخدامه بعد ذلك لتحويل سلالة بكتيرية يتم فحص استنساخها بعد الانتقاء. يتم استخدام الاستنساخ الخلوي عند استخدام PCR لأنه لا جدوى من استخدام نظام خلوي (بكتيريا، خميرة، خلية حيوانية أو نباتية) لتضخيم الاستنساخ.
• التعرف على البصمات الجينية المستخدمة في الطب الشرعي والتي تستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لربط الدم أو اللعاب أو الأنسجة المتروكة في مسرح الجريمة بالمشتبه به أو الضحية.
• يستخدم علماء الوراثة السريرية تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد ما إذا كان الوالدان المحتملان يحملان مرضًا وراثيًا يمكن أن ينتقل إلى أطفالهم أم لا.
• التطور القائم على الحمض النووي ، أو التحليل الوظيفي للجينات.
• تشخيص الأمراض الوراثية.
• كشف وتشخيص الأمراض المعدية.

تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل في مجال الأمراض المعدية

 

انضم الى معامل براكسيلابس الافتراضيه الان

 

يمكن أن تحدث الأمراض المعدية بسبب مسببات الأمراض الجرثومية، بما في ذلك العوامل الفطرية، والطفيليات، والبكتيرية، والكلاميديا، والريكتسيا، والطبيعة الفيروسية. على الرغم من التطورات العديدة في التشخيص واللقاحات، لا تزال الأمراض المعدية لها عواقب وخيمة في جميع أنحاء العالم.

ثلاثة أمثلة على الأمراض المعدية الخطيرة بسبب تربية الحيوانات منذ التسعينيات تشمل ظهور البريون، اعتلال الدماغ الإسفنجي البقري (BSE)و التفشي الهائل لمرض الحمى القلاعية (FMD) في أوروبا وأنفلونزا الطيور (AI) في آسيا وأماكن أخرى. يمكن أن ينتقل عدد كبير من هذه الأمراض المعدية من الحيوانات الفقارية إلى الإنسان (تسمى الأمراض الحيوانية المنشأ).

تنتقل الأمراض المعدية عادةً عن طريق الجلد أو العينين (الاتصال المباشر، وناقلات الحشرات، وجروح اللدغات، والاتصال الجنسي). في حالات أخرى تنتقل العوامل جواً وتصيب الخلايا المبطنة للقناة التنفسية حيث يمكن أن تبدأ العدوى الجهازية الأخرى. المصادر الإضافية للكائنات الدقيقة المعدية هي الطعام والماء الملوثان بطريق العدوى عن طريق الفم والجهاز الهضمي، أو من خلال الجهاز التنفسي.

يتم توجيه تكنولوجيا التشخيص المختبري إما نحو الكشف عن وجود أو عدم وجود العامل الممرض وتحديده وتوصيفه أو اكتشاف التأثير المرضي أو الاستجابة المناعية للعدوى بواسطة أحد مسببات الأمراض.

يمثل تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR تقنية جديدة تمامًا. تُستخدم الزراعة البكتيرية أو الفيروسية في المختبر على نطاق واسع لعزل ومضاعفة مسببات الأمراض، بحيث يمكن اكتشاف الكائن الحي نفسه، أو مستضداته بسهولة أكبر من خلال التواجد بكميات أكبر وبوجه عام مع عدد أقل من الملوثات.

تسمح تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتطبيق نفس المبدأ (أي التضخيم في المختبر) للكشف عن تسلسلات معينة للحمض النووي. هناك فوائد هائلة لهذا النهج. لقد اقتصر تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على تشخيص المرض إلى حد ما على المختبرات ذات المرافق والمعدات والتمويل والخبرة المطلوبة. و يجب أن يتم الإجراء في ظروف نظيفة للغاية لأن التلوث بكميات صغيرة من الحمض النووي الدخيل قد يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.

تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) واكتشاف العدوى بفيروس كورونا

أحد أهم تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل الآن هو الكشف عن عدوى COVID-19.

في الآونة الأخيرة، مع ظهور فيروس COVID-19  غالبًا ما نسمع مصطلح “تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل”. وهو التحليل الأساسي المستخدم حاليًا للكشف عن المصابين بـ COVID-19.

من خلال تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل، يمكن للعلماء اكتشاف وجود فيروسات تسبب العدوى حتى عندما تكون موجودة بكميات صغيرة في الجسم. تساهم هذه الطريقة في تشخيص الأمراض الفيروسية المعدية وكذلك في تحديد الطفرات في الاضطرابات الوراثية المختلفة.

لمزيد من المعلومات، يمكنك قراءة مقالتنا تحليل PCR: طريقة اكتشاف العدوى COVID-19 … تجارب مبادرة PraxiLabs

ابدا تجاربك مع براكسيلابس الان مجانا!

 

مختبر براكسيلابس الافتراضي لتجرب تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسي أو التقليدي PCR

تقدم PraxiLabs محاكاة لاختبار PCR التقليدي لجعل الطلاب يكتسبون خبرة عملية في المبدأ والممارسة على تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR).

خطوات التجربة :

• قم بالتجهيز للتفاعل بارتداء القفازات في جميع الأوقات وقم بتسمية أغطية الإيبندورف.
• تحضير كمية من الخليط الأساسي (Master Mix) كافية لـ 6 عينات من الحمض النووي عن طريق إضافة الكواشف الخاصة للتجربة في أنبوب المزيج الرئيسي.يتكون هذا الخليط من:-

243 مل ماء مقطر (40.5 * 6).

30 مل من المحلول المنظم  10X PCR والذي يحتوي على MgCl2 (5 * 6).

6 مل من 10 مم dNTPs (1 * 6).

6 مل من (1 * 6)البادئ الأمامي.

6 مل من  (1 * 6) البادئ الخلفي.

3 مل من انزيم بوليميراز DNA Taq polymerase (0.5 * 6).

 

• أضف 49 مل من Master Mix الذي قمت بتحضيره للتو إلى 1 مل من كل عينة DNA.
• ضع أنابيب eppendorfs في جهاز التدوير الحراري وقم بإجراء تمسخ تهيئة عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لدورة واحدة.
• نفذ الدورات المتعددة التي تنقسم إلى ثلاث خطوات متتالية:

خطوة التمسخ: عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 30 دورة.

خطوة التلدين: عند 50-65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 30 دورة.

خطوة الاستطالة: عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، 30 دورة.

• قم بإجراء الاستطالة النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لدورة واحدة.
• نفذ الخطوة الأخيرة في التجربة وهي الانتظار النهائي عند 4 درجات مئوية لفترة غير محددة لدورة واحدة.

فيديو لتوضيح خطوات محاكاة تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR الأساسي

قم بإنشاء حسابك المجاني الآن وجرب المعمل الافتراضي لمحاكاة تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي PCR 

جرب الان تفاعل البوليميراز المتسلسل pcr فى معاملنا الافتراضيه